15221734409
相關文章
Related Articles詳細介紹
過表達轉基因小鼠
外源基因（如人類疾病相關基因）隨機插入基因組，導致組成型或組織特異性過表達。
基因敲入（Knock-in, KI）小鼠
將外源基因精準插入特定位點（如內源基因啟動子控制下），或引入點突變/報告基因（如GFP）。
條件性轉基因小鼠
利用組織特異性Cre/loxP系統實現時空特異性表達（如僅在肝臟中表達）。
適用場景：隨機插入過表達轉基因
步驟：
載體設計：構建包含目標基因的質粒（需有啟動子、外源基因、polyA信號等）。
線性化DNA制備：去除質粒骨架，提高整合效率。
受精卵注射：將DNA注射到受精卵的原核中（C57BL/6等品系）。
胚胎移植：將注射后的胚胎移植到假孕母鼠子宮。
基因型鑒定：通過PCR或Southern blot檢測F0代小鼠的轉基因整合。
優缺點：
優點：技術成熟，適用于大片段（可達數百kb）。
缺點：隨機整合可能導致表達不穩定或位置效應。
適用場景：精準插入或內源基因替換
步驟：
設計gRNA和供體DNA：
gRNA靶向插入位點，供體DNA包含同源臂（~800 bp）和目標序列。
遞送系統：
將CRISPR組件（Cas9 mRNA + gRNA）與供體DNA共注射到受精卵。
驗證：通過長片段PCR或測序確認精準整合。
優缺點：
優點：高效、精準，可插入大片段（需結合同源重組）。
缺點：需優化同源重組效率，可能產生非預期插入。
適用場景：復雜修飾（如條件性敲入）
步驟：
構建靶向載體：含同源臂、目標基因及篩選標記（如NeoR）。
ES細胞轉染與篩選：通過陽性/陰性選擇（如PNS）獲得正確重組的ES克隆。
囊胚注射：將ES細胞注入囊胚，移植后獲得嵌合體小鼠。
繁育傳代：嵌合體與野生型交配獲得雜合子后代。
優缺點：
優點：精準可控，適合復雜設計。
缺點：周期長（6個月以上），成本高。
Cre-loxP系統
將目標基因兩側插入loxP位點，與組織特異性Cre小鼠交配后實現條件性表達或敲除。
常用啟動子：Alb（肝臟）、Nestin（神經）、Vil1（腸道）。
Tet-On/Off系統
通過四環素或強力mei素誘導基因表達（如肝特異性Tet-OFF-Alb-rtTA）。
表達驗證
需通過qPCR、Western blot或免疫組化確認外源基因表達水平和組織分布。
表型分析
根據目標基因功能設計表型檢測（如行為學、病理學、代謝指標）。
品系選擇
常用背景品系：C57BL/6（遺傳穩定）、BALB/c（免疫研究）。
遺傳穩定性
需連續傳代驗證轉基因的穩定遺傳（部分品系可能出現沉默或丟失）。
| 問題 | 可能原因 | 解決方案 |
|---|---|---|
| 轉基因未整合 | 注射DNA質量低或效率不足 | 優化DNA純化，提高注射技術 |
| 表達水平低 | 位置效應或啟動子弱 | 使用絕緣子（如HS4）或強啟動子（CAG） |
| 嵌合體比例低 | ES細胞貢獻不足 | 選擇高貢獻ES細胞系（如JM8） |
| 非特異性表型 | 插入突變或脫靶效應 | 多獨立品系驗證，全基因組測序排查 |
阿爾茨海默病模型：過表達人類APP突變基因（如APP/PS1雙轉基因）。
癌癥模型：條件性激活致癌基因（如KrasG12D; p53loxP）。
報告基因模型：敲入熒光蛋白（如Rosa26-LSL-tdTomato）追蹤細胞譜系。
產品咨詢
歡迎來到
